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 猪人工授精站技术管理操作规范
  实验室管理规范
  人工授精站实验室是精液检查、处理、贮存的场所,为了生产出优质的、符合输精要求的精液,一定把好质量关,保证出站的每一瓶精液的活力不低于0.7, 72小时之内保存活率不受影响,特对实验室日常运作做如下规定。
   1、 实验室要求整洁、干净、卫生,每周彻底清洁一次;
   2、 非实验室工作人员在正常情况下不准进入实验室,采精员也不准进入实验室;
   3、 所有仪器设备应在仔细阅读说明书后,由专人按操作规程使用和维护保养;特别是高压蒸气灭菌器,超声波洗净器,双蒸水器使用时更应注意人身安全;
   4、 各种电器设备应按其要求选择适应插座,除冰箱、精液保存箱、恒温培养箱等外,一般电器要求人走断电,干燥箱无人时设定温度不应高于100℃;
   5、 物品、器皿的清洗、消毒方法:所有器皿应以洗洁精或洗衣粉清洗干净,再以蒸馏水漂洗,60℃干燥(玻璃用品干燥温度可高于100℃)后,以锡纸包扎器皿开口,玻璃器皿180℃ 1小时进行干热灭菌,非耐热器皿、用具以高压灭菌器121℃、20分钟湿热灭菌;
  6、 稀释液的配制、精液检查、稀释、分装一定按照人工授精操作规程进行。
  7、 实验室仪器设备保持清洁卫生:实验室内使用的仪器设备,如显微镜、干燥箱、水浴锅、17℃精液保存箱、冰箱、37℃恒温板、电子天平等,必然保持清洁卫生,显微镜镜头(目镜和物镜),应每2周用二甲苯浸泡一次,保持清洁;
  8、 采精室与实验室之间的传递口的两测窗只有在传递物品时才能按先后顺序开启使用;
  9、 实验室地板、实验台保持干净清洁;
  10、 下班离开实验室前一定检查电源、水龙头、门、窗是否关闭好,做到万无一失方可离开实验室,确保安全;
  11、 防火防盗,注意安全。
  采精的操作规程
   1、 采精员一手带双层手套,另一手持37℃保温杯(内装1次性食品袋)用于收集精液;
   2、 饲养员将待采精的公猪赶至采精栏,用0.1%高锰酸钾溶液清洗其腹部和包皮,再用温水(夏天用自来水)清洗干净,避免药物残留对精子的伤害;
   3、 采精员挤出公猪包皮积尿,按摩公猪包皮部,刺激其爬跨假台畜;
   4、 公猪爬跨假台畜并逐步伸出阴茎,脱去外层手套,将公猪阴茎龟头导入空拳;
   5、 用手(大拇指与龟头相反方向)紧握伸出的公猪阴茎螺旋状龟头,顺其向前冲力将阴茎的“S’’状弯曲拉直,握紧阴茎龟头防止其旋转,公猪即可射精;
   6、 用四层沙布过滤收集浓份精液于保温杯内的一次性食品袋内,最初射出的少量精液含精子很少,可以不必接取,有些公猪分2-3个阶段将浓份精液射出,直到公猪射精完毕,射精过程历时5-7分钟;
   7、 采精员应注意安全,一旦公猪出现攻击行为,采精员应立刻逃至安全角;
   8、 下班之前彻底清洗采精栏;
   9、 采精期间不准欧打公猪,防止出现性抑制;
   10、采精频率:成年公猪每周2次,青年公猪(1岁左右)每周1次。最好固定每头公猪的采精频率;
   11、公猪采精调教:①后备公猪7月龄开始进行采精调教;②每次调教时间不超过15分钟;③一旦采精获得成功,分别在第2、3天再采精1次,进行巩固掌握该技术;④采精调教可采用发情母猪诱导、观摩有经验公猪采精、以发情母猪分泌物刺激等方法;⑤调教公猪要有耐心,不准打骂公猪;⑥注意公猪和调教人员的安全。
   稀释液配制操作规程
   1、 配制稀释液的药品要求选用分析纯试剂,对含有结晶水的试剂要按摩尔浓度进行换算(如含水葡萄糖和无水葡萄糖);
   2、 按稀释液配方,用称量纸、电子天平准确称量药品;
   3、 按1000ml、2000ml剂量称量稀释粉,置于密封袋中;
   4、 使用前将称量好的稀释粉溶于定量的双蒸水中,可用磁力搅拌器助其溶解;
   5、 用滤纸过滤,以尽可能除去杂质;
   6、 用1N稀盐酸或1N氢氧化钠调整BTS稀释液的PH值为7.2(6.8-7.4)左右,渗透压为330mOsm;稀释液配好,应及时贴上标签,标明品名、配制日期和时间、经手人等;
   7、 要认真检查已配制好的稀释液成品,发现问题及时纠正;
   8、 液态状稀释液冰箱4℃保存,不超过24小时,超过有效贮存期的变质稀释液应废弃。
   精液品质的检查操作规程
   1、 精液量:以电子天平称量精液,按每克1毫升计,避免以量筒等转移精液盛放容器的方法测量精液体积;
   2、 颜色:正常的精液是乳白色或浅灰白,精子密度越高,色泽愈浓,其透明度愈低。如带有绿色或黄色是混有脓液或尿液,若带有淡红色或红褐色是含有血液。这样的精液应舍弃不用,会同兽医寻找原因;
   3、 气味:猪精液略带腥味,如有异常气味,应废弃;
   4、 pH值(酸碱度):以PH计测量(PH计使用见说明书);
   5、 精子活率检查:活率是指呈直线运动的精子百分率,在显微镜下观察精子活率,一般按0.1-1.0 的十级评分法进行,鲜精活率要求不低于0.7;
   6、 精子密度:指每毫升精液中所含的精子数,是确定稀释倍数的重要指标。要求用血细胞计数板进行计数或精液密度仪测定。血细胞计数板计数方法:①以微量加样品取具有代表性原精液100μl,3%NaCl 900μl,混匀,使之稀释10倍;②在血细胞计数室上放一盖玻片,取1滴上述精液放入计数板的槽中,靠虹吸将精液吸入计数室内;③在高倍镜下计数5个中方格内的精子总数,将该数乘以50万,即得原精液每毫升的精子数(即精液密度)。精液密度仪使用见其说明书;
   7、 精子畸形率:畸形率是指异常精子的百分率,一般要求畸形率不超过18%,其测定可用普通显微镜,但需伊红或姬姆沙染色,相差显微镜可直接观察活精子的畸形率,公猪使用过频或高温环境会出现精子尾部带有原生质滴的畸形精子;畸形精子种类很多,如:巨型精子、短小精子、双头或双尾精子,顶体膨胀或脱落、精子头部残缺或与尾部分离、尾部变曲。要求每头公猪每两周检查一次精子畸形率;
   8、 按要求做好精液品质检查登记表;
   9、 实事求是地填写种公猪健康状况登记表,从而真实地反应种公猪健康状况。
   精液的稀释操作规程
   1、 精液采集后应尽快稀释,原精贮存不超过30分钟;
   2、 未经品质检查或检查不合格(活力0.7以下)的精液不能稀释;
   3、 稀释液与精液要求等温稀释,两者温差不超过1℃,即稀释液应加热至33℃-37℃,以精液温度为标准,来调节稀释液的温度,绝不能反过来操作;
   4、 稀释时,将稀释液沿盛精液的杯(瓶)壁缓慢加入到精液中,然后轻轻摇动或用消毒玻璃棒搅拌,使之混合均匀;
   5、 如作高倍稀释时,应进行低倍稀释(1:1-2),稍待片刻后再将余下的稀释液沿壁缓慢加入,以防造成“稀释打击”;
   6、 稀释倍数的确定:活率≥0.7的精液,一般按每个输精剂量含40亿个总精子,输精量为80-90ml确定稀释倍数,例如: 某头公猪一次采精量是200ml ,活力为0.8,密度为2亿/ ml,要求每个输精剂量是含40亿精子,输精量为80ml,则总精子数为200ml×2亿/ml=400亿,输精头份为400亿÷40亿=10份,加入稀释液的量为10×80ml-200ml=600ml;
   7、 稀释后要求静置片刻再作精子活力检查,如果稀释前后活力一样,即可进行分装与保存,如果活力下降,说明稀释液的配制或稀释操作有问题,不宜使用,并应查明原因加以改进;
   8、 不准随便更改各种稀释液配方的成分及其相互比例,也不准几种不同配方稀释液随意混合使用;
   9、 稀释液的配方见附表。
   精液的常温保存的操作规程
   1、 精液稀释后,检查精液活率,若无明显下降,按每头份80-90 ml分装;
   2、 瓶上加盖密封,并在输精瓶上写清楚公猪的品种、耳号,采精日期(月、日、时);
   3、 置22℃-25℃的室温1小时后(或用几层毛巾包被好后)直接放置17℃冰箱中;
   4、 保存过程中要求每12小时将精液混匀一次,防止精子沉淀而引起死亡;
   5、 每天检查精液保存箱温度并进行记录,若出现停电应全面检查贮存的精液品质;
   6、 尽量减少保存精液保存箱关开次数,以免造成对精子的打击而死亡。
   发情鉴定技术的操作规程
   1、 母猪发情周期平均21天(19--23天),大多数经产母猪一般在仔猪断奶后的一周内(3--7天),可再次发情排卵,配种受胎;
   2、 母猪发情周期可分为发情前期、发情期、发情后期和间情期,母猪只有在发情才允许公猪爬跨或称之为站立反应,此性行为表现可作为母猪适时输精的指标;
   3、 各期特征,略述如下:①发情前期:母猪举动不安,外阴肿胀,并由淡黄色变为红色这种变化在后备母猪较为明显;阴道有粘液分泌,其粘度渐渐增加。在此期母猪不允许人骑在背上,平均可有2.7天,不宜输精配种。②发情期:平均约2.5天,特征为母猪阴部肿胀及红色开始减退,分泌物也变浓厚,粘度增加。此时母猪允许压背而不动,压背时,母猪双耳竖起向后,后肢紧绷。③发情后期:1-2天,发情母猪的阴部完全回复正常,不允许公猪爬跨;④间情期:13-14天,完全恢复正常状态;
   4、 发情鉴定:每日最少要做两次试情(每天上午6:30-8:30和下午16:00-17:30进行发情检查),即在安静的环境下,有公猪在旁时,压背,以观察其站立反应。试情公猪一般选用善于交谈、唾液分泌旺盛、行动缓慢的老公猪;
   5、 作好发情检查的完整记录:包括发情母猪耳号、胎次、发情时间、外阴部变化、压背反应等,尤其是后备母猪的记录。
   输精操作规程
   1、 输精次数:①第1次自然交配、第2、3次人工授精;②2次人工授精;③3次人工授精;
   2、 输精时间:①断奶后3-6天发情的经产母猪,发情出现站立反应后6-12小时进行第1次输精配种;②后备母猪和断奶后7天以上发情的经产母猪,发情出现站立反应,就进行配种(输精);
   3、 精液检查:从17℃保存箱取出的精液,轻轻摇匀,用已灭菌的滴管取1滴放于预热的载玻片,置于37℃的恒温板上片刻,用显微镜检查活力,精液活力≥0.7,才可进行输精;
   4、 将试情公猪赶至待配母猪栏之前,使母猪在输精时与公猪口鼻部接触;
   5、 输精人员消毒清洁双手;
   6、 用0.1%高锰酸钾水溶液清洁母猪外阴、尾根及臀部周围,再用温水浸湿毛巾,擦干外阴部;
   7、 从密封袋中取出没受任何污染的一次性输精管(手不应接触输精管前2/3部分),在其前端涂上精液作为润滑液;
   8、 将输精管45度角向上插入母猪生殖道内,输精管进入3-4cm之后,顺时针旋转,当感觉有阻力时,继续缓慢旋转同时前后移动,直到感觉输精管前端被锁定(轻轻回拉不动),并且确认真正被子宫颈锁定;
   9、 从精液贮存箱取出品质合格的精液,确认公猪品种、耳号;
   10、 缓慢颠倒摇均精液,用剪刀剪去瓶嘴,接到输精管上,开始进行输精;
   11、 用针头在输精瓶底部扎一个小孔,抚摸母猪的乳房或外阴、压背刺激母猪,使其子宫收缩产生负压,将精液吸纳;输精时勿将精液挤入母猪生殖道内,防止精液倒流;
   12、 控制输精瓶的高低来调节输精时间,输精时间要求3-5分钟,输完一头母猪后,应在防止空气进入母猪生殖道的情况下,把输精管后端一小段折起,放在输精瓶中,使其滞留在生殖道内3-5分钟,让输精管慢慢滑落;
   13、 从17℃精液保存箱中取出的精液,无需升温至37℃,摇匀后可直接输精,但检查精液活力需将玻片预热至37℃;
   14、 经产母猪用一次性海绵头输精管,输精前检查海绵头是否松动;后备母猪用一次性螺旋头输精管。为防止子宫炎发生,每头母猪每次输精都应使用一条新的输精管;
   15、 每头母猪在一个发情期内要求至少输精两次,最好三次,两次输精时间间隔8小时左右;
   16、 认真登记母猪生产卡、配种记录。

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